摘要：烟草主要是以叶片为主要收获对象的经济作物，烟草早花是烟草栽培中常见的灾害现象。发生早花的烟株植株矮小，有效叶数少，不仅削弱了烟草的生长势、直接影响烟草的产量，还可能会影响到烟叶内在化学成分的协调、进而影响烟叶品质。本研究在对模式植物已有信号通路基因进行分析以及结合逆境胁迫下基因表达谱分析的前期基础下，根据转录组测序结果，从中选择了20个候选基因进行VIGS载体的构建，后利用VIGS基因沉默技术对候选基因进行了基因沉默；通过基因沉默之后的开花表型鉴定，最终确定其中4个基因与烟草开花调控相关。

关键词：烟草；早花；VIGS；基因筛选

Screening and Phenotypic Identification of Tobacco Flowering Regulatory Genes

Abstract： Tobacco is an economic crop with the main purpose of harvesting leaves. Early flowering tobacco is a common disaster in tobacco cultivation.  Early flowering tobacco plants are dwarf and the number of effective leaves is small, which not only weakens the growth potential of tobacco, directly affects the yield of tobacco, but also may affect the coordination of the internal chemical components of tobacco leaves, and thus affect the quality of tobacco leaves.  In this study, based on the previous analysis of signal pathway genes in model plants and the analysis of gene expression profiles under stress, we selected 20 candidate genes for the construction of VIGS vector and then used VIGS genes according to the results of transcriptome sequencing. The silencing technique was used to gene silence the candidate genes. After the flowering phenotype after gene silencing, four genes were finally determined to be related to tobacco flowering regulation.

Key words: Tobacco; Early flowering; VIGS; Gene screening

目  录

摘要3

关键词3

Abstract3

Key words3

1前言 4

1.1研究背景 4

1.2国内外研究状况 4

2材料与方法5

2.1试验材料 5

2.2 试验方法 5

2.2.1本氏烟草的培养 5

2.2.2 VIGS载体的构建5

2.2.2.1候选基因VIGS靶标片段的PCR扩增 5

2.2.2.2将候选基因VIGS靶标片段克隆到gateway入门载体中5

2.2.2.3将靶标片段的克隆到gateway VIGS目的载体TRV2中5

2.2.2.4将带有靶标片段pTRV2 VIGS目的载体转入农杆菌 6

2.2.3采用VIGS技术进行基因沉默6

2.3表型观察与数据处理 6

3 结果与分析 7

3.1候选基因引物设计 7

3.2候选基因载体构建 8

3.3开花时期各基因对应植株表型 9

3.4开花植株株数差异性分析11

3.5开花时生长天数差异性分析12

3.6开花时叶片数差异性分析12

3.7结论13

致谢14

参考文献14

烟草开花调控基因的筛选及表型鉴定

1  前言

1．1 研究背景

烟草是我国重要的经济作物之一，烟草行业在我国的国民经济总量中占有很大比重。目前，我国烟草的种植总面积以及烟叶的总产量均居世界首位，栽培生产烤烟主要集中在云南、贵州、四川、河南、湖南、福建等地，在我国西北、东北等部分地区也栽种了少量的黄花烟。栽培的品种主要为普通烟草(Nicotiana tabacum L.)和黄花烟草两种(Nicotiana rustica L.)。普通烟草又称红花烟草，如烤烟、晾烟、晒烟、白肋烟、香料烟等，黄花烟则均为晒烟。烟草产量极大的受到烟草植株花期的影响，逆境条件情况下烟草早花极易发生，发生早花的烟株不仅植株矮小，有效叶数少，而且叶片薄又小，严重影响了烟叶的产量、品质和经济效益。我国主要的烟草种植区域均发生过不同程度的早花灾害现象，对烟草产区经济造成了较大的影响，所以筛选出调控烟草开花的有效基因迫在眉睫。

   病毒诱导的基因沉默(Virus-induced gene silencing，VIGS)是指携带目标基因片段的病毒在侵染植物后，诱导植物内源基因沉默、引起表型变化，进而根据表型变异研究目标基因的功能。VIGS是根据植物对RNA病毒防御机制发展起来的一种技术，其内在的分子基础可能是转录后基因沉默(post-transcript gene silence)。与传统的基因功能分析方法相比.VIGS能够在侵染植物当代对目标基因进行沉默和功能分析；可以避免植物转化；克服功能重复；可以在不同遗传背景下起作用，对基因功能分析更透彻。VIGS已被广泛应用于植物抗病抗逆、生长发育以及代谢调控等生理途径相关基因的功能鉴定。与转基因、基因敲除、反义抑制等基因功能研究方法相比，VIGS技术研究周期短，不需要遗传转化，具有低成本、高通量等优势。目前，病毒诱导的基因沉默(VIGS)技术已被证明是一种快速、高通量筛选烟草抗逆功能基因的技术。利用VIGS体系验证参与逆境胁迫诱导早花过程中烟草候选基因功能，可进一步缩小候选基因范围。