常用构建载体的方法是酶切连接，但是用这种方法构建质粒载体不易成功。为了有效解决用酶切／连接技术构建表达载体时出现的问题，Invitrogen公司根据λ噬菌体基因组合大肠杆菌基因组之间的位点专一性重组分子机制开发了一套分子克隆新技术，即通路(Gateway)克隆技术。 本次研究主要利用的是Gateway核心技术[5]中的BP反应和LR反应，使用基因特异性序列GGGG-attB1或attB2序列，PCR扩增目的基因的时候就可以得到两侧带有attB1/2基因的片断，然后将PCR产物与上述供体载体（带有attP1-ccdB-attP2序列）进行混合，加入BP酶，25℃保温1-3小时，利用位点特异性重组转化并构建含有目的基因的入门载体[6-8]。LR反应则是把目的基因从入门载体转移到表达载体，这就需要将上一步得到的两种质粒混合，然后加入LR酶，让attR2序列与attL2序列发生重组，生成一个融合的质粒。attL1序列再与attR1序列发生重组，这样融合质粒就可以分解成两个新的质粒，此时目的基因和原来位于表达载体上的那个自杀基因发生重组置换，就可获到一个带有目的基因的表达载体和带有自杀基因的入门载体，整个反应过程都需要25℃保温1-3小时，即可完成转化得到所需要的表达载体。本研究利用Gateway技术成功构建了植物的双元表达载体35SS-slr1509-3xHA，为后续研究与CCM相关的其它基因在植物体内的功能以及能否提高植物的光合作用效率提供了基础。

1.材料和方法

本实验所用仪器及试剂均由周口师范学院植物遗传与分子育种重点实验室提供。1.1实验材料

1.1.1质粒材料

（1）PCC6803的基因组DNA

（2）pDONR207

（3）35SS-GW-3HA

1.1.2酶和试剂

1.1.2.1酶

 KAPA HIFI DNA聚合酶(KAPA BIOSYTEMS)

 2×Taq PCR StarMix with loading Dye(Genstar)

1.1.2.2抗生素

 Gentamycin （庆大霉素）50 mg/ml      溶于水  过滤除菌 -20℃保存

 Spectinomycin （壮观霉素）100 mg/ml  溶于水  过滤除菌 -20℃保存

1.1.2.3生化试剂及配制

 大肠杆菌感受态，农杆菌感受态均由实验室提供，琼脂糖凝胶、核酸染色剂、TAE缓冲液、pDONR207、BP酶、LR酶、Loading Buffer、2KMaker、2×PCRMix酶、蒸馏水等。