本研究选取与CCM相关基因中的一个Slr0009号基因，通过利用最新的gateway技术来构建目的基因表达载体，Gateway技术作为一种新兴的DNA克隆重组技术，主要分为两步：BP反应与LR反应。在 BP 反应中，经纯化的 PCR 产物和含有 attP 位点的供体载体( pDONRvector) DNA 分子进行重组反应，使末端含有 attB重组位点的 PCR 产物插入含有 attP 位点的供体载体中，产生具有 attL 位点的入门克隆载体( pENTR vector) 。在 LR 反应中，含有 attL 位点的入门克隆载体和含有attR 位点的目的载体 DNA 分子之间发生重组反应，产生带有 attB 位点的表达载体( pEXP) 。希望通过本实验的研究，为探究与CCM途径相关的基因是否能够提高蓝藻的光合作用效率和集胞藻6803其他方面的研究提供一定的理论基础。

1材料和方法

1.1实验仪器

 超净工作台、摇床、离心机、冰箱、精密电子天平、移液枪、温箱、pH计、涡旋振荡器、光照培养箱、微波炉、电泳仪、PCR扩增仪、透射紫外观察仪、水浴锅、高压灭菌锅、电泳槽等。

1.2试剂

 Tryptone、Yeast extract、NaCl、 BP酶、LR酶、引物、Mixtaq、琼脂糖、艾德莱质粒小提试剂盒、艾德莱PCR纯化试剂盒、甘油、Mark、Gentamycin(Gen.sigma)、 Spectinomycin（Spe.sigma）、内切酶（HindⅢ、EconⅤ等）、loading buffer、蒸馏水等。

(1)液体LB培养基的配方如下：

试剂 含量

Tryptone 1%

Yeast extract 0.5%

NaCl 1%

(2)固体LB培养基的配制：

向液体LB培养基中加入1.5%琼脂，121℃灭菌15min。

(3)引物序列和用途如下：

引物序号 引物序列 引物用处

LYJ1 GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCATGGTACAAGCCAAAGCAGGGT 含有attB位点扩增Slr0009基因

LYJ2 GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTcGAGGGTATCCATGGCCTCG

LYJ3 TCGCGTTAACGCTAGCATGGATCTC 验证入门载体

LYJ4 GTAACATCAGAGATTTTGAGACAC

LYJ5 ACAATCCCACTATCCTTC 用来验证表达载体

LYJ6 GACACACGAAATAAAGTAATC

(4)50× TAE配制如下：

试剂 含量

Tris碱 242 g

Na2EDTA·2H2O 37.2 g

去离子水， 800ml

冰醋酸 57.1 ml

加去离子水定容至 1 L。

1.3 实验方法

1.3.1PCR反应

加入高保真酶，用于目的基因的克隆，PCR反应体系(15μl)。

模板DNA 0.5μl

Primer1 3μl

Primer2 3μl

KAPA HIFI酶 25μl

ddH2O 18.5μl

反应条件如下：

95℃预变性3min,98℃变性20s,60℃退火20s,72℃延伸30s,扩增30个循环，延伸5min,16℃保存。

1.3.2产物纯化

PCR产物纯化使用的是购自艾德莱生物科技公司的PCR产物纯化回收试剂盒，操作步骤如下：

(1)向吸附柱中加100μl Buffer PE,13000rpm离心30s,弃去废液。

(2)加200μl溶胶液DD于 PCR产物中,再向吸附柱中加入200μl溶胶液DD ，已加入溶胶液DD的PCR产物也加入平衡过的吸附柱内。

(3)开始第一次200rpm离心1min ，继续第二次12000rpm离心1min，弃收集管内液体。

(4)向离心柱内加入600μl漂洗液WB(已加乙醇)，12000rpm离心1min，弃上清。

(5)再向离心柱内加入600μl漂洗液WB(已加乙醇)，12000rpm离心2min，弃上清，再空转2min。

(6)取出吸附柱，放入1.5ml离心管内，65℃烘箱，1min后立即取出。

(7)向吸附膜的中加入30μl已65℃加热的EB, 于65℃烘箱放置2min，12000rpm离心1min。