蓝藻是光合细菌，集胞藻(Synechocystis sp.) PCC6803是蓝藻的一种，是一种生活在中温的单细胞微生物,整个细胞基因组序列早已测序完成,集胞藻由于具有成熟的遗传操作系统，因此，目前已成为研究蓝藻生命活动的模式生物[3]。集胞藻(Synechocystis sp.) PCC6803的一个显著优点就是具有独特的CO2 浓缩机制(CO2-concentrating mechanism，CCM)，该机制的作用就是能够增强集胞藻的固碳能力。在集胞藻CO2 浓缩机制中发挥重要作用的结构是羧酶体，是一种存在于蓝藻细胞内的有助于固定CO2 ，提高光合作用的酶[4]。在蓝藻和一些自养微生物中，羧酶体作为类似细胞器的结构，内部含有多种与固定CO2 有关的酶，其中最重要的是碳酸酐酶 (Carbonic anhydrase，CA)和1,5-二磷酸核酮糖羧化酶(RubisCO) ，在无机碳转运蛋白的协作下，能够共同在蓝藻细胞质中积累HCO3–，最终通过增加 RubisCO 周围的CO2 浓度，来提高蓝藻的光合作用效率[5]。

基因克隆和载体构建在植物功能基因组研究中较为常见[6]。构建植物表达载体是植物基因工程的一个重要组成部分，植物表达载体携带目的基因进入宿主细胞后，能够在启动子和多种酶的作用下进行复制、转录和翻译。想要验证某个外源基因的功能，我们可以把外源目的基因构建成植物表达载体，并通过合适的方法将其导入到能够表达该外源目的基因的宿主细胞内，从而进行复制、转录和翻译。在植物性状改良上常用该方法。因此，在进行遗传转化时，构建一个稳定，高效的植物表达载体是实验的首要前提。

传统的用于构建复杂植物载体的方法，需要仔细选择限制性酶切位点，有时还需要建立更多的中间载体, 操作比较繁琐，费时费力，因此寻找简单，快捷的载体构建方法，具有重要的现实意义[13-14]。在这个实验中使用载体的构建方法是Gateway 技术。

Gateway 技术是由 Invitrogen 公司开发的，其原理是借助位点特异性重组，能够进行基因克隆的一项新技术[7-9]。Gateway技术包括BP反应和LR反应，通过BP反应可以使纯化的PCR扩增的外源目的基因方便、快捷地克隆到入门载体上，形成入门克隆，通过LR反应可以将入门载体与受体载体形成表达载体。通过此就可以将目的基因快速、简洁地构建到表达载体中，使用Gateway系统不仅能够突破传统的质粒构建模式，而且简化了克隆的步骤，在植物表达载体的构建中被广泛使用，其主要过程见图一。

本文结合自己的实验工作主要介绍了用Gateway技术构建植物表达载体，为后续的获得转基因阳性植株和植物光和效率研究奠定基础。

1.材料与方法

1.1实验材料

1.1.1菌株

大肠杆菌Trans5α感受态细胞和农杆菌GV3101感受态细胞均有周口师范学院植物遗传与分子育种重点实验室提供。

1.1.2 质粒载体

集胞藻6803二氧化碳浓缩机制相关基因组DNA由周口师范学院植物遗传与分子育种重点实验室提供。

入门载体：pDONR207 周口师范学院植物遗传与分子育种重点实验室提供

表达载体：35SS-GW-3xHA周口师范学院植物遗传与分子育种重点实验室提供

1.1.3酶和试剂

1.1.3.1酶

2×Taq PCR StarMix with loading Dye(Genstar)

KOD plus DNA聚合酶(Toyobo)

BP重组酶

LR重组酶

1.1.3.2 抗生素

Gentamycin(Sigma)

Spectinomycin(Sigma)

抗生素配制

Kanamycin 50mg/ml   溶于水  过滤除菌 -20℃保存

Gentamycin 50 mg/ml  溶于水  过滤除菌 -20℃保存

1.1.3.3实验试剂

琼脂、50×TAE缓冲液、Gold view试剂、6x上样缓冲液（loading buffer）、DNA分子大小标准参照物、无水乙醇、75%乙醇、异丙醇、75%甘油、蒸馏水、LB培养基各组成成分、洗脱液（WB）、高纯度质粒小量快速提取试剂盒购自艾德莱生物科技公司。