1.1.2 单克隆抗体的构建解析

单克隆抗体是由融合细胞产生的一种具有高都专一性的抗体，而融合细胞室友分离的血浆细胞和不凋亡细胞融合而成，只能生产单一的单克隆抗体。大部分的单克隆抗体从CHO（中国仓鼠卵巢细胞）细胞中提取的，也意味着残留了宿主细胞和DNA残留会对治疗起到免疫反应的危险（只有人类的抗体才能够对人类起到免疫作用[4]。

CHO细胞的表达：[5]在对产生了免疫反应的基因工程敲除鼠, 用杂交瘤技术使小鼠的淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合。再通过灭活内源性的小鼠抗体基因, 引进人源抗体基因片段, 当对人源抗体免疫的时候就可以在小鼠体内产生全人抗体分子完成抗体的构建。另一种方法是将人抗体基因微位点转入CHO细胞,又因为小鼠CHO细胞的免疫抗原基因环境和人类的免疫抗原基因环境非常相似。CHO细胞是生产全人单抗的最理想方法，构建简单周期短。目前, 对于CHO细胞的表达对全人源化抗体的研究目标，现在已经有许多单克隆抗体用CHO细胞表达。

1.2 单克隆抗体纯化研究概况

1.2.1 单克隆抗体纯化简介

The purification of Downstream(下游纯化) 与上游发酵相对概念，一般而言，上游指的是基因克隆，细胞培养发酵等对目的产物的表达工序，而下游纯化指的是从表达有目的样品的复杂混合液中分离纯化，从而得到符合要求的目的产物的一系列操作。目前，在美、日、欧等发达国家的生物工程技术产品工业化的实践中可以证明： 生物技术产品高度依赖于基因工程下游工序和设备技术的进步。  

1.2.2 单克隆抗体纯化流程

单克隆抗体纯化主要可以分为5步，其中包括细胞液深层过滤，亲和层析，阴离子流穿层析，阳离子结合层析，纳滤超滤共5个流程。在单克隆抗体生产工艺中由于上游细胞培养完成后的细胞液里面含有大量杂质，例如CHO细胞，细胞碎片,宿主DNA，HCP，病毒等等。需要下游纯化对细胞液进行提取，纯化。从而等到纯净对人有益的抗体药物。如图1.1蛋白纯化流程图所示

（1）细胞液的深层过滤：用来去除大分子颗粒例如细胞、细胞碎片，细胞颗粒大小在15毫米左右，深层过滤能够去除大于0.1毫米的颗粒，使细胞液澄清，便有接下来的层析实验。

（2）亲和层析：[6-9]使用层析柱填料的特异性结合原理进行对目标蛋白的捕捉，其特点是①选择性好，一次纯化后的抗体纯度能够大于99％；②能够使抗体浓度增大，洗脱液的抗体浓度>10g／L；③有效灭活病毒；④ 适用于所有人源的(~IgG3)抗体~IlFc融合蛋白，减少缓冲液的种类和用量。

（3）阴离子流穿层析：采用流穿的模式，使杂质吸附在阴离子层析柱上，目标蛋白抗体洗脱流穿过阴离子柱，阴离子交换柱处理量大、动态载量高、纯化效果好、回收率高，适合用于精制单克隆抗体的纯化工艺中，但由于每个抗体的含量杂质不同，需要进行实验选择合适的条件[10]。

（4）阳离子结合层析：[11]由于宿主细胞蛋白质、DNA残留、脱落的亲和Protein A配基和内毒素均带负电，不能被阳离子柱吸附，被缓冲液洗脱下来，而蛋白抗体都是带正电荷被层析柱吸附保留下来。

（5）纳滤：利用小于0.1毫米的纳滤膜包能有有效的拦截在生产过程中可能携带内毒素、病毒。而目标抗体一般都是在145~165kDa左右，不会被膜包拦截，所以经过超滤后的样品基本可以用于制剂使用。